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說一說T100基因擴增儀由哪三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成

更新時間:2021-06-25      瀏覽次數(shù):1592
   T100基因擴增儀實際就是一個溫控設(shè)備,能在95℃,55℃,72℃之間很好地進行溫度控制。
 
  本質(zhì)是體外核酸擴增,加熱使雙鏈DNA解開螺旋,在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交,在TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物,重復“變性→退火→引物延伸”過程至25~40個循環(huán),呈指數(shù)級擴大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)。
 
  擴增時加入的引物利用熒光素進行標記,使引物和熒光探針同時與模板進行特異性結(jié)合,擴增結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號并輸送到計算機分析處理系統(tǒng),實時輸出量化結(jié)果,這樣的PCR儀叫實時熒光定量PCR儀。
 
  T100基因擴增儀的操作非常簡便,接通電源,儀器自檢,設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲存的程序運行即可。
 
  T100基因擴增儀技術(shù)的原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
 
  1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備。
 
  2、模板DNA與引物的退火:模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈互補序列配對結(jié)合。
 
  3、引物的延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。
 
  重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一輪循環(huán)需2~4分鐘,如此反復進行,每一輪循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一輪循環(huán)的模板,每一輪循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增1倍,PCR產(chǎn)物以2的指數(shù)形式迅速擴增,經(jīng)過25~30輪循環(huán)后(2~3小時),理論上可使基因擴增109倍以上,實際上一般可達106~107倍。

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